Ekstrakcja alkaloidów z grzybów je zawierających

Journal of Basic Microbiology
Vol 34, 1994; 17-22
by Jochen Gartz

Pełny tekst artykułu:

Przez ostatnie 15 lat wiele razy publikowano materiały na temat wykrywania i wyodrębniania psychotropowych pochodnych tryptaminy: psylocybiny, psylocyny, baeocystyny z grzybów (Gartz 1992, 1993).

Różne metody ekstrakcji alkaloidów z grzybów opierały się głównie na użyciu metanolu jako rozpuszczalnika (Beug i Bigwood 1982, Gartz 1987, Sottolano i Lurie 1983).

W 1985 roku opisano wodno-organiczną metodę ekstrakcji za pomocą kwasu octowego (Casale 1985). Ostatnio, czescy analitycy do ekstrakcji pochodnych indolu z grzyba Psilocybe bohemica Sebek użyli wodnych roztworów metanolu i etanolu (czystych lub z dodatkiem azotanu potasu) (Kysilka i Wurst 1990, Wurst et al 1992). Twierdzono, że możliwe jest uzyskanie większej ilości psylocyny używając do ekstrakcji wodnego roztworu etanolu zamiast bezwodnego metanolu oraz że możliwe jest użycie obu metod razem. W tej pracy opierano się na metodach ekstrakcji psylocybiny, psylocyny i baeocystyny z różnych gatunków grzybów włącznie z P. bohemica Sebek przy użyciu metanolu i innych mieszanin rozpuszczalników (Casale 1985, Kysilka i Wurst 1990, Wurst et al. 1992).

Materiały i metody:

Grzyby: Hodowane sztucznie: Psilocybe semilanceata (FR.) Kumm hodowane na końskim oborniku (Gartz 1991); Psilocybe cubensis (Earle) Singer hodowane na mieszaninie krowiego gnoju i ryżu (Gartz 1989a); P. bohemica hodowany na ryżu/wodzie (Gartz i Mueller 1989; Gymnopilus purpuratus (Cooke i Mass) Singer hodowane na ryżu/trocinach (Gartz i Mueller 1990, Gartz 1991).

Grzyby rosnące naturalnie: Panaeolus cyanescens (BK & BK) SACC. (Oahu, Hawaje 13.11.88); Inocybe aeruginascens Babos (Poczdam 20.05.1987); P. bohemica Sebek (przy Sazava, Czechy 15.11.89).
Wszystkie basidiocarps zostały wysuszone w temp. pokojowej. Pozostałości wody usunięto zamrażając (freeze-drying). Pojedyńcze okazy z każdego gatunku pozostawiono w herbarium Uniwersytetu w Liepzig (LZ).

Metoda ekstrakcji: Próbki (0.01-0.1 g) suchych i zmielonych grzybów ekstraktowano 5 do 20 ml metanolu przez 0.5 do 12 godzin używając mieszadełka magnetycznego w temperaturze pokojowej. W takich samych warunkach ekstraktowano przy użyciu wodnego roztworu kwasu octowego (Casale 1985) oraz wodnego roztworu etanolu (psylocyna) i metanolu (psylocybina) (Kysilka i Wurst 1990, Wurst et al. 1992), których użyto na tych samych porcjach grzybów. Przy użyciu roztworów alkoholi zmieniono czas ekstrakcji na 10 minut dla psylocybiny i 160 minut dla psylocyny (Kysilka i Wurst 1990). Używając rozcieńczonego kwasu octowego, próbkę po ekstrakcji umieszczano w łaźni wodnej na 10 minut po czym analizowano, a następnie była analizowana 10 minut po ekstrakcji i analizie, po czym analizowano ją jeszcze raz (Casale 1985).

Rozdzielanie i analizę pochodnych indolu za pomocą HPLC i TLC opisano gdzie indziej (Gartz 1987, Semerdzieva et al. 1986, Wurst et al. 1992). Analizę na obecność enzymów fosfatazy (? phosphatase) w ekstraktach również opisano w innej pracy (Weber i Horita 1963).

Wyniki:

W doświadczeniu tym ekstrakcja czystym metanolem psylocyny, psylocybiny i baeocystyny nie była ukończona po 30 minutach dla wszystkich gatunków, a nawet po sześciu godzinach przy analizie P. cubensis i G purpuratus. Całkowite wyodrębnienie alkaloidów z masy grzybów obserwowano po 12 godzinach. Po tym czasie nie otrzymano żadnych pochodnych indolu ekstraktując próbkę wodnym roztworem metanolu/etanolu czy kwasu octowego lub też używając chloroformu przy psylocynie.

Baeocystynę czyli niekompletnie zmetylowany odpowiednik i prawdopodobny prekursor psylocybiny (Gartz 1989a) wykryto we wszystkich badanych grzybach ekstraktując je metanolem, ale w niektórych przypadkach wykryto ją w bardzo małych ilościach (Tabela 1).

Psylocybina i psylocyna występowała w takich samych ilościach, w jakich wykrywano ją wcześniej (Gartz 1992, 1993). Ta substancja jest estrem kwasu fosforowego jak psylocybina i baeocystyna. Podobne ilości psylocyny wykryto w ekstraktach z P. cubensis i G. purpuratus przy użyciu wodnego roztworu kwasu octowego kontra metanol (Tabela 2). Zawartość psylocybiny i psylocyny była ta sama pod względem ilości jak ta odkryta wcześniej (Gartz 1992, 1993). Substancja ta wygląda na ester kwasu fosforowego, tak jak psylocybina i baeocystyna. Podobne stężenie psylocyny wykryto w ekstraktach P. cubensis i G. Purpuratus przy użyciu wodnego roztworu kwasu octowego zamiast czystego metanolu (tabela 2).

Tabela 1
Zawartość alkaloidów indolowych w grzybach różnych gatunków w ekstraktach przy użyciu czystego metanolu jako rozpuszczalnika (%, sucha masa).

Tabela 2
Zawartość alkaloidów przy użyciu kwasu octowego do ekstrakcji suchych grzybów (%, sucha masa).

Tabela 3

Używając do ekstrakcji mieszaniny etanolu z metanolem udało się uzyskać więcej psylocyny z każdych badanych grzybów, jednak zawsze wyodrębniano mniej psylocybiny niż kiedy stosowano czysty metanol (Tabela 3).

Dodatkowo, można było wykryć dużą aktywność enzymów fosfatazy w wodnych roztworach wszystkich gatunków grzybów. Kiedy użyto kwasu octowego jako rozpuszczalnika, tylko ekstrakt z P. cubensis i P. cyanescens pokazywał znaczącą aktywność enzymów. Przez to psylocybina kompletnie przekształcała się (za pomocą enzymów, dephosphorylated) do psylocyny kiedy ogrzewano próbkę z ekstraktem z kwasu octowego, pozatym nie wykryto baeocystyny w P. cyanescens.

Komentarz

Wiadomo, że ekstrakcja na metanolu potrzebuje czasu ponad 12 godzin w temperaturze pokojowej (Beug i Bigwood 1982, Gartz 1987, Semerdzieva et al. 1986) lub jedną godzinę przy 45°C (SCOTTOLANO i Lurie 1983) by ekstrakcja przebiegła całkowicie (czyli by zostały wyodrębnione wszystkie alkaloidy).

W naszych badaniach psylocyna wykazywała duże stężenie przy prostej ekstrakcji metanolem różnych gatunków (Gartz 1987, 1989c, 1991). Przeprowadzając ilościową analizę na pochodne indolu po biotransformacji tryptaminy i podobnych związków w owocnikującej grzybni P. cubensis wykryto dużą zawartość psylocyny w każdym grzybie, dla przykładu w tych ekstraktowanych metanolem (Gartz 1989a, b). Czescy analitycy, używając wodnego r-ru metanolu i etanolu jako rozpuszczalnika do analizy P. bohemica, nie zawsze analizowali tą samą partię grzybów (Kysilka, osobisty kontakt (pers. communication) 1989).

Znaleźliśmy różnice między pojedynczymi grzybami każdego gatunku, także na P. bohemica pobieranych z tego samego terenu (Gartz i Mueller 1989), jak również z kontrolowanych (uprawianych?) kultur (Gartz 1991). Dodatkowo, dużą aktywność enzymów fosfatazy w wodno-alkoholowych roztworach ekstraktów z P. cubensis i innych zawierających psylocybinę grzybów wykryto i opisano wiele lat temu (BOCKS 1968, Gartz 1993, Weber i Horita 1963). Enzymy te wyodrębniono rozpuszczalnikiem zawierającym wodę i powodowały one częściową defosforylację psylocybiny do psylocyny (Tabela 1 i 3). Używając tych roztworów obserwowano w niektórych przypadkach sinienie mieszaniny po ekstrakcji, a był to sygnał częściowego utlenienia psylocyny (BOCKS 1968, Gartz 1989a, Weber i Horita 1963). Interesującym jest, że większość baeocystyny rozkładała się podczas ekstrakcji wodą zawierającą alkohol (Tabela 1 i 3).

Casale (1985) opisał szybkie tworzenie psylocyny po całkowitej defosforylacji psylocybiny przy ogrzewaniu ekstraktu na rozcieńczonym kwasie octowym. Jest teraz jasne, że przemiana ta jest powodowana udziałem enzymów i nie jest powodowana samym kwasem. Dla przykładu estry kwasu fosforowego i psylocybiny, baeocystyny i aeruginascyny (aeruginascin) w tychże kwasowych ekstraktach z I. aeruginacens były stabilne przy ogrzewaniu w przeciwieństwie do tych samych alkaloidów w roztworach P. cubensis i P. cyanescens. Wygląda na to, że aktywne enzymy fosfatazy można wyodrębnić wodnym roztworem kwasu octowego tylko z tych dwóch odmian - w przeciwieństwie do ekstrakcji z użyciem wodnych roztworów alkoholi. Poza tym próby rozdzielenia psylocybiny i psylocyny prostymi metodami używając mieszaniny organicznych rozpuszczalników i wody były niezadawalające (THOMSON 1980).

Badania te pokazują, że wysokie stężenie psylocyny w P. bohemica (Kysilka i Wurst 1990, Wurst et al. 1992) i brak jej wykrycia wcześniej (Gartz i Mueller 1989) były sztucznym zjawiskiem spowodowanym enzymatyczną przemianą psylocybiny przy użyciu wodnych roztworów organicznych rozpuszczalników. Ekstrakcja z czystym metanolem jest najbezpieczniejszą metodą przy wyodrębnianiu związków z rodziny indoli z grzybów różnych gatunków.

Podziękowania

Autor dziękuje następującym osobom: G. Drewitz, J. Allen, G.K. Mueller oraz M. Semerdzieva który geneously supplied herbarium material and/or valuable information.

Bibliografia

Tekst oryginalny w języku angielskim z erowid.org.